大家知道分光光度計的工作原理是1、物質對光的選擇吸收，2、瑯伯-比爾定律。我們這里討論瑯伯-比爾定律的限制性條件。其一：通過溶液的光必須是平行的；其二：通過溶液的光必須是單色光；其三：待測溶液必須是純凈的、均勻的且濃度不宜過高，這是瑯伯-比爾定律首要的三個前提條件。但是在實際的分光光度計的制造和使用過程中這三個條件是不可能達到的。其一：因為光是直線傳播的，在分光光度計制造過程中，燈源發出的光是發散的，經過聚焦鏡進行聚焦等直到經過溶液的整體過程中，光是不可能平行的。其二：燈源發出的光是復合光，經過狹縫，再經過光柵分光等步驟，因為受到狹縫和光柵本身的限制，光柵分光不可能達到純單色光。還有光度計的整體設計問題，光度計不可能沒有其它的雜光存在。其三：用戶的溶液也不可能是純凈的，也會含有一些雜質，這些對光度的吸收都會存在影響。除以上三個方面的影響外，在實際的光度計應用過程中還會存在其他因素的影響，例如：1、經過比色皿的光是否垂直；2、比色皿寬度是否為10mm的標準值；3、測試波長是否準確；4、程序設計是否存在漏洞等等，都會直接影響到利用瑯伯-比爾定律計算出的結果。
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