久青草影院丨免费黄网在线观看丨黄色短视频在线播放丨成人av动漫在线观看丨亚洲熟妇色xxxxx亚洲丨黄色av一级丨91亚色在线观看丨狠狠天堂丨亚洲第一在线播放丨亚洲欧洲偷自拍图片区丨你懂的视频在线播放丨国产精品综合色区小说丨香蕉视频免费丨亚洲妇熟xx妇色黄蜜桃丨日本一区中文字幕丨青青在线视频人视频在线丨亚洲最大福利视频网丨日批视频免费看丨国产精品一区12p丨aaaaa女高潮免费视频

瓊脂擴(kuò)散法是測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)常用的方法，但人為操作因素常常影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)旨在 建立一種測(cè)定準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊設(shè)備的分光光度計(jì)比濁法來(lái)測(cè)定各種抗菌物質(zhì)的效價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，以抑 菌率高時(shí)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為取樣時(shí)間點(diǎn)，在中等接種量下，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，細(xì)菌素 nisin、類細(xì)菌素 NFL 和 抗生素硫酸慶大霉素這 3 種抗菌物質(zhì)的濃度與抑菌率之間的線性關(guān)系良好，Ｒ2 值均高于 0. 99，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。 該法適用于設(shè)備條件簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確測(cè)定各類抗菌物質(zhì)效價(jià)。

抗菌物質(zhì)是指具有殺菌或抑菌活性的物質(zhì)，包括 細(xì)菌素、類細(xì)菌素和抗生素等生物活性物質(zhì)。在過(guò)去 的 60 多年里，多種能準(zhǔn)確測(cè)定抗菌物質(zhì)活性的方法 先后被提出，包括 ATP 生物發(fā)光測(cè)定法( ATP Bioluminometry) 、綠色熒光蛋白測(cè)定法( GFP bioassay) 、 MTT［3-( 4，5-dimethyl thiazol-2-yl) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide］比色法、免疫學(xué)方法等 ［1 － 4］，然而 使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設(shè)備，因此沒(méi)有 得到廣泛應(yīng)用。長(zhǎng)期以來(lái)，瓊脂擴(kuò)散法( agar diffusion assay) 因無(wú)需特殊材料，檢測(cè)成本低［5 － 6］而成為測(cè)定 抗菌物質(zhì)活性常用的方法，但是該法耗時(shí)耗力、對(duì) 操作人員經(jīng)驗(yàn)要求高、人為影響因素多，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常 得不到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［7］。1952 年，Berridge 和 Barrett 應(yīng)用微孔比濁法來(lái)測(cè)定抗生素效價(jià)［8］，經(jīng)過(guò) 幾十年的不斷改進(jìn)，該法已以成為可以定量測(cè)定抗菌 物質(zhì)的一種方法［9 － 10］，但是，需要使用酶標(biāo)儀這一 “短板”限制了其廣泛應(yīng)用，如能建立起分光光度計(jì) 比濁法無(wú)疑將極大提高其應(yīng)用普遍性。為此本研究 對(duì)于影響分光光度計(jì)比濁法準(zhǔn)確定量抗菌物質(zhì)效價(jià) 的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，建立了測(cè)定細(xì)菌素 nisin、類 細(xì)菌素 NFL［11］和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質(zhì)效 價(jià)的分光光度計(jì)比濁法。

1 材料與方法

1. 1. 1 菌種 金黃桿菌( Chryseobacterium) NHW 菌株、乳酸乳 球菌( Lactococcus lactis) NFL 菌株和乳酸乳球菌( L. lactis) 8148 菌株，為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn) 室保藏。 1. 1. 2 培養(yǎng)基 STAA 培 養(yǎng) 基: 蛋 白 胨 20 g，酵 母 抽 提 物 2 g， K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，甘油 15 g，瓊脂 13 g， 蒸餾水 1 000 mL，pH 7. 0 ± 0. 2，121 ℃下 15 min 滅菌 后冷卻至 40 ～ 50 ℃ 左右，加入過(guò)濾除菌的鏈霉素 500 mg，環(huán)己六亞胺 50 mg 和乙酸鹽 50 mg 混勻，用 于培養(yǎng)金黃桿菌 NHW 菌株。 MＲS 培養(yǎng)基: 牛肉浸膏 8. 0 g，Tween-80 1. 0 mL， 葡萄糖 20. 0 g，胰蛋白胨 10. 0 g，酵母抽提物 4. 0 g， K2HPO4 2. 0 g，檸檬酸三銨 2. 0 g，醋酸鈉 5. 0 g，MnSO4·H2O 0. 05 g，MgSO4·7H2O 0. 2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6. 0 ± 0. 2。用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 NFL 菌株。 GM17 培養(yǎng)基: 補(bǔ)充了 15 g /L 葡萄糖的 M17 培 養(yǎng)基( 購(gòu)自青島海博) ，用于培養(yǎng)乳酸乳球菌 8148 菌 株。 1. 2 實(shí)驗(yàn)方法 1. 2. 1 抗菌物質(zhì)抗菌類型的確定 乳酸乳球菌 NFL 發(fā)酵上清液的制備: 將活化后 的乳酸乳球菌 NFL 菌株以 5% 接種量接種于 MＲS 液 體培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng) 12 h，離心( 10 000 r /min，15 min) 取上清液，將上清液過(guò)濾除菌，取濾液備用。 硫酸慶大霉素、氯霉素和類細(xì)菌素 NFL 抗菌類 型的確定: 將活化后的指示菌金黃桿菌 NHW 菌株以 5% 接種量接種于 STAA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取菌體，用生理鹽水洗 滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水中，分別添加終質(zhì)量 濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液、888. 89 U / mL 的硫酸慶大霉素水溶液、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌 上清液，30 ℃下振蕩 ( 150 r /min) 培養(yǎng) 6 h，分別在 培養(yǎng)的 0 時(shí)刻和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 STAA 平板表面，30 ℃下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。 nisin 抗菌類型的確定: 將活化后的指示菌乳酸 乳球菌 8148 菌株以 5% 接種量接種于 GM17 液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心( 10 000 r /min，5 min) 取 菌體，用生理鹽水洗滌 1 次，將菌體重懸于生理鹽水 中，添加終濃度為 1. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 0. 02 mol /L) 。30 ℃下靜置培養(yǎng) 6 h，分別在培養(yǎng)的 0 h 和 6 h 取 200 μL 發(fā)酵液涂布于 GM17 平板表面，30 ℃ 下培養(yǎng)測(cè)定菌落總數(shù)。 1. 2. 2 不同抗菌物質(zhì)抑菌率曲線的測(cè)定 將活化后的指示菌以 2% 的接種量接種于相應(yīng) 的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組分別加入終質(zhì)量濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液 ( 對(duì)照為無(wú)水乙醇) 、 888. 89 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液( 對(duì)照為無(wú)菌 水) 、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液( 對(duì)照為 MＲS 培養(yǎng)基) 和 0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 對(duì)照為 0. 02 mol /L HCl 溶液) ，培養(yǎng)過(guò)程中每隔 2 h 取樣，立 即轉(zhuǎn)入冰水浴中以終止微生物生長(zhǎng)，于 600 nm 波長(zhǎng) 處測(cè)定吸光值( 上海奧析，UV1800紫外可見(jiàn)分光光度 計(jì)) ，連續(xù)測(cè)定至 14 h。對(duì)照組加入量與實(shí)驗(yàn)組體積 相同，其余方法同實(shí)驗(yàn)組。 抑菌率/% = ( OD對(duì)照 － OD實(shí)驗(yàn)) /OD對(duì)照 × 100 1. 2. 3 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立 1. 2. 3. 1 指示菌接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響 乳酸乳球菌 8148 接種量對(duì) nisin 效價(jià)測(cè)定取樣 時(shí)間點(diǎn)的影響: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株分 別以 2% 、5% 、8% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn) 組中加入終濃度為0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，分別 在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 1、2、3 h，取樣，測(cè)定抑菌率和發(fā) 酵液濁度增量，濁度增量 OD600 = OD600實(shí)驗(yàn) － OD600起始。 金黃桿菌 NHW 接種量對(duì)類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)測(cè) 定取樣時(shí)間點(diǎn)的影響: 將活化后的金黃桿菌 NHW 分 別以 1% 、2% 、3% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn) 組中加入終濃度為 66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上 清液，分別在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 3、4、5 h 取樣，測(cè)定抑 菌率和發(fā)酵液濁度增量 OD600。 1. 2. 3. 2 測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后的乳酸乳 球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí) 驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 2、0. 5、0. 8、1. 1、1. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣測(cè)定 抑菌率。另一實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 4、0. 8、1. 2、 1. 6、2. 0、2. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜 置培養(yǎng) 5 h，取樣測(cè)定抑菌率。 2 h 取樣的 nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn): 將 活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 0. 4、1. 0 U / mL 的 nisin 鹽酸溶液，在 30 ℃ 下靜置培養(yǎng) 2 h，取樣 測(cè)定抑菌率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè) 樣品的測(cè)定誤差率( ＲSD) 。 ＲSD/% = 抑菌率( 實(shí)際) － 抑菌率( 擬合) 抑菌率( 實(shí)際) × 100 類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后 的金黃桿菌 NHW 以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 36. 67、43. 33、50. 00、 56. 67、63. 33 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，分別 在 30 ℃下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測(cè)定抑菌率。測(cè)定終濃 度為 40、60 μL /mL 的 NFL 菌株發(fā)酵上清液的抑菌 率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算這兩個(gè)樣品的測(cè) 定誤差率( ＲSD) 。 硫酸慶大霉素效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將活化后的 金黃桿菌 NHW 菌株以 2% 的接種量接入 STAA 培養(yǎng) 基，實(shí)驗(yàn)組中加入終濃度為 444. 44、533. 33、622. 22、 711. 10、799. 99、888. 88 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶 液，分別在 30 ℃ 下振蕩培養(yǎng) 4 h，取樣測(cè)定抑菌率。 測(cè)定終濃度為 577. 77、755. 55 U /mL 的硫酸慶大霉 素水溶液的抑菌率，用所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算 這兩個(gè)樣品的測(cè)定誤差率( ＲSD) 。 2 結(jié)果與分析 2. 1 不同抗菌物質(zhì)的抑菌率曲線 從圖 1 可以看出，隨著指示菌在硫酸慶大霉素水 溶液中處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐步被殺死，失去生長(zhǎng) 能力。而指示菌在 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上 清液中處理 6 h，活菌數(shù)下降幅度均很小，nisin 和氯 霉素是已知的抑菌劑，表明 NFL 菌株發(fā)酵上清液具 抑菌活性而非殺菌活性。 在指示菌培養(yǎng)基中分別添加以上各種抗菌劑 后，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，計(jì)算得到抑菌率曲線。從圖 2 可見(jiàn)，抑菌類抗菌劑 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發(fā)酵上

2 抗菌物質(zhì)效價(jià)分光光度計(jì)比濁法的建立 2. 1 接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響 抑菌率計(jì)算的依據(jù)是生物量，而接種量的大小會(huì) 直接影響微生物細(xì)胞生物量的高低，因此研究了指示 菌接種量對(duì)取樣時(shí)間點(diǎn)的影響。從圖 3 可以看 出，中等( 5% ) 和較高( 8% ) 接種量下測(cè)定 nisin 濃度 的取樣時(shí)間點(diǎn)均為 2 h。低接種量( 2% ) 下，指 示菌培養(yǎng) 3 h 的抑菌率高于 2 h 的，導(dǎo)致測(cè)定 nisin 濃 度的取樣時(shí)間點(diǎn)延后。取樣時(shí)間點(diǎn)的確定 不僅取決于高抑菌率，還要兼顧指示菌生長(zhǎng)增量和 培養(yǎng)時(shí)間，如圖 3 所示，低接種量( 2% ) 下指示菌培 養(yǎng) 3h 的 對(duì) 照 組 ( 未 添 加 nisin ) 發(fā)酵液濁度增量 ( OD600 ) 很低，表明此時(shí)體系中的活菌量較低，不能很 好地表征 nisin 的抑菌效力，且培養(yǎng)時(shí)間偏長(zhǎng)。因此， 以乳酸乳球菌 8148 為指示菌來(lái)測(cè)定 nisin 濃度指示菌接種量為 5% ，取樣時(shí)間點(diǎn)為 2 h。

2. 2 分光光度計(jì)比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲 線的建立 2. 2. 1 測(cè)定 nisin 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以 5% 接種量接種指示菌乳酸乳球菌 8148，在 GM17 培養(yǎng)基中添加不同終濃度的 nisin，培養(yǎng) 2 h，測(cè) 定抑菌率，以抑菌率對(duì) nisin 濃度值進(jìn)行線性回歸。 由圖 5 可知，在 nisin 終濃度為 0. 2 ～ 1. 4 U /mL，抑菌 率為 25% ～ 98% 的范圍內(nèi)，nisin 濃度與抑菌率之間 呈良好的線性關(guān)系( Ｒ2 = 0. 9921) ，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)( 表 1) 表明，該方法的準(zhǔn)確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。在非取樣時(shí)間點(diǎn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的 Ｒ2 值低于 0. 99，表明此時(shí)取樣測(cè)定所得數(shù)據(jù)的線性相關(guān)度偏
 

2. 2. 2 測(cè)定類細(xì)菌素 NFL 效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 乳酸乳球菌 NFL 菌株發(fā)酵上清液中含有類細(xì)菌 素 NFL，與 nisin 不同，NFL 菌株發(fā)酵上清液不是純 品，其中還含有未被細(xì)胞利用完的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn) 物，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本比濁法同樣適用于發(fā)酵液中抑菌物 質(zhì)活性的定量測(cè)定。以 2% 接種量接種指示菌金黃 桿菌 NHW 菌株，在 STAA 培養(yǎng)基中添加不同體積的 NFL 菌株發(fā)酵上清液，培養(yǎng) 4 h，測(cè)定抑菌率，以抑菌 率對(duì) NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量進(jìn)行線性回歸。由 圖 6 可知，在 NFL 菌株發(fā)酵上清液添加量為 36 ～ 64 μL /mL，抑菌率為 7% ～ 58% 的范圍內(nèi)，發(fā)酵上清液 添加量與抑菌率之間的線性相關(guān)良好( Ｒ2 = 0. 994) ， 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)( 表 2) 表明該方法的準(zhǔn)確度較高( ＲSD ＜ 5% ) 。

2. 2. 3 測(cè)定硫酸慶大霉素效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由圖 7 可知，nisin 測(cè)定取樣時(shí)間點(diǎn)( 2 h) 所 對(duì)應(yīng)的時(shí)刻是實(shí)驗(yàn)組( 培養(yǎng)基中含 0. 5 U /mL 的 nisin) 生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)前期。如前所述，硫酸慶大霉素 的抑菌率曲線與 nisin 等抑菌劑的不同，并沒(méi)有呈現(xiàn) 明顯的峰值，但在 4 h 時(shí)抑菌率會(huì)處于一直較高的平 臺(tái)，此時(shí)對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組也基本處于對(duì)數(shù)前期。

3 討論 采用比濁法測(cè)定抗菌物質(zhì)特別是抗生素效價(jià)的 文獻(xiàn)不少，方法大致都是將抗菌物質(zhì)加入指示菌培養(yǎng) 體系中培養(yǎng)一段時(shí)間( 一般為 2 ～ 5h) 測(cè)定濁度，抗菌 物質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)與濁度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 ( Ｒ2 ＞ 0. 99) ［12 － 14］。但這些報(bào)道中均沒(méi)有說(shuō)明抗菌 物質(zhì)與指示菌培養(yǎng)時(shí)間( 即取樣測(cè)定濁度的時(shí)間點(diǎn)) 的確切依據(jù)。李秀蘭等采用分光度度計(jì)比濁法測(cè)定 抗菌肽活性，抗菌肽濃度與活力單位之間線性關(guān)系良 好，但是操作較為復(fù)雜，需要將對(duì)數(shù)期的指示菌菌體 洗滌后重懸于緩沖液中，加入抗菌肽樣品振蕩培養(yǎng) 30 min 后測(cè)定濁度，將所測(cè)結(jié)果代入經(jīng)驗(yàn)公式得到活 力單位［15］。同樣，作者也沒(méi)有說(shuō)明為何要培養(yǎng) 30 min，這樣對(duì)于其他種類抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定，并不具 有直接的借鑒意義。 本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質(zhì) 濃度之間直接建立線性相關(guān)，并且找到了抑菌劑和抗 菌劑效價(jià)線性定量測(cè)定的關(guān)鍵因子，即取樣時(shí)間點(diǎn)。 以 nisin 和硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定為例( 圖 5 和圖 9) ，如果取樣時(shí)間點(diǎn)選擇得不好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Ｒ2 值就會(huì)小于 0. 99，達(dá)不到線性相關(guān)的要求。無(wú)論是 nisin 這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑，取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的都是實(shí)驗(yàn)組( 即培養(yǎng)基中加入 抗菌物質(zhì)) 生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)前期( 圖 7 和圖 8) ，這種 規(guī)律性可能是因?yàn)楸痉ú捎玫囊志手笜?biāo)依據(jù)的是 對(duì)照組活細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組中未被抑制或殺死的活細(xì)胞 生長(zhǎng)能力的比較，當(dāng)取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)前 期，實(shí)驗(yàn)組生物量基本可以反映當(dāng)時(shí)的活細(xì)胞數(shù); 如 果取樣時(shí)間點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)數(shù)末期，實(shí)驗(yàn)組生物量會(huì) 包含部分死細(xì)胞，就會(huì)偏離效價(jià)與抑菌率之間的線性 相關(guān)了。 除此之外，接種量的大小對(duì)抑菌率的高低有顯著 的影響( 圖 3 和圖 4) ，雖然低接種量下高抑菌率值 較高，但取樣時(shí)間點(diǎn)會(huì)延后，且指示菌生長(zhǎng)速度 偏低，并不能很好地表現(xiàn)出抑菌物質(zhì)的作用; 高接種 量從檢測(cè)時(shí)間和高抑菌率方面均較差，因此，接種 量的優(yōu)化對(duì)于提高本方法的應(yīng)用效果十分必要。 本研究所建立的分光光度計(jì)比濁法不僅可用來(lái) 準(zhǔn)確測(cè)定 nisin、類細(xì)菌素 NFL 和慶大霉素的效價(jià)，而 且具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。有理由相信，本 方法也可以適用于其他抗菌物質(zhì)效價(jià)的測(cè)定。首先， 測(cè)定抗菌物質(zhì)抑菌率曲線，以此為依據(jù)，抑菌劑以 高抑菌率對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)為取樣時(shí)間點(diǎn)，殺菌劑可以結(jié) 合實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)曲線和抑菌率曲線，綜合考慮實(shí)驗(yàn)組對(duì) 數(shù)前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時(shí)間點(diǎn); 隨 后，測(cè)定指示菌不同接種量下的抑菌率，確定合適的 指示菌接種量; 后，建立抑菌率與抗菌物質(zhì)效價(jià)之 間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。